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MTT染色法:让细胞生长看的见


随着病原微生物学、药理学和肿瘤学研讨的不停深化和开展,科研部分和临床医院反抗肿瘤药物、微生物病原体及活菌计数、细胞毒性的研讨检测事情日益增多,以往接纳的检测办法好像位素法、台盼蓝法以及 ELISA 法等,虽能测定出响应实行后果,但检测历程中多因操纵历程繁琐、检测周期长、需特定仪器设置装备摆设、易净化情况等而不尽人意。临时以来,人们不停努力于探究新的更疾速、更正确的检测办法来满意科研部分和医院测定事情的必要。MTT 比色法是20世纪 80 年月开展起来的一种检测细胞数目和增殖情况的办法,自Mosmann于1983年首创 MTT 比色法用于检测IL-2的生物学活性以来,MTT法依附操纵轻便、反复性好等好处而遭到人们的广泛喜爱,现已普遍使用于各个范畴。
 
1 MTT比色法的原理、办法及特点
1.1根本原理
MTT,即溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-dipenyl terazolium bromide〕,cas 298-93-1简称四唑盐,又名噻唑蓝;MTT产品为淡黄色粉末,易被水消融和透太好了胞膜而进入细胞内。可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶复原,构成不溶于水的蓝紫色Fortnazam结晶。该结晶可溶于酸性异丙醇、二甲亚砜、SDS等无机溶剂中,经过多孔扫描分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光度值。由于结晶物构成的量与细胞数目及代谢活性成比例,因而吸光度(A)值的巨细可反应细胞的数目及活性。
 
1.2根本操纵历程
1.2.1制备靶细胞,将细胞接种于细胞培育板中,依据靶细胞差别选择每孔1口一1护个差别的细胞数,预培育(或无)。
1.2.2参加待测的细胞因子或化学药物等,同时设响应的比较,置37℃5%CO2情况中培育,培育工夫随测定内容及靶细胞差别而异。
1.2.3培育停止前4h参加5mg/ml的MTT溶液10~25μl/孔。
1.2.4停止培育,将所构成的结晶物用无机溶剂完全消融后,在分光光度计上测定其在波长490nm或570nm处的A值(差别溶剂利用测定波长差别)。用回归法或概率法推算出活性因子的单元、药物敏理性或效应细胞杀伤率等。
1.3 MTT比色法的特点
1.3.1特异性强。由于琥珀酸脱氢酶只存在于活细胞线粒体内,而不存在于上清液中,以是去世细胞和红细胞均不影响测定后果。
1.3.2敏捷度高。本法在检测巨噬细胞毒活性闭、LAK细胞毒活性等时敏捷度均高于同位素法;在检测抗癌药物敏理性方面比台盼蓝法正确、敏捷、特异。
1.3.3疾速、正确、反复性好。培育和比色历程中不需洗濯细胞,省时并可制止细胞的丧失,并且比色测定可半主动化,受人的客观要素影响较小,从而增加了样品偏差,可同时对大样本,多种要素举行检测。
1.3.4操纵轻便、节流质料、不铸特定仪器,无同位素净化,便于实行室展开使用。
 
2 MTT比色法的使用
2.1 动物抗细胞增殖物质身分挑选研讨中的使用
2.1.1 中草药提取物体外抗肿瘤活性
据《本草大纲》等纪录,蛇六谷(魔芋)具有性寒、味平、化痰散积及行淤消肿之功,用于医治咳嗽、疟疾、痴肥风毒等 . 因有解毒抗癌之效而被古代用于医治种种恶性肿瘤 。接纳 MTT 比色法察看蛇六谷各提取物对人肝癌 HepG-2 细胞及大鼠胶质瘤C6细胞增殖克制作用举行药物挑选,后果标明:蛇六谷醋酸已酯萃取物、煤油醚萃取物对HepG-2细胞及C6细胞呈分明的量效增殖克制作用; 林董等也接纳MTT比色法,对芸香、低榆、甘草、柴胡、莪术、蜜蒙花、半边莲和旱芹等8种中草药体外抗肺癌细胞SPC-A1的活性举行检测。后果标明,浓度为1.5mg/mL的莪术乙醇浸提液(ESCC)和甘草乙醇浸提液(ESCG)对体外培育的肺癌细胞SPC-A1呈较强的浓度依赖性克制增殖作用。综上实行都是经过MTT法来反响细胞增殖形态从而直接对中草药体外抗肿瘤作用及机制的研讨举行了开端探究,为其临床医治肿瘤提供了实际根据,且奠基了从自然中草药中开辟抗肿瘤新药底子,但其作用机制仍不太明白而有待进一步研讨 。
2.1.2 胡桃楸提取物克制弓形虫增殖
文秋嘉等搜集熏染弓形虫小鼠腹水并浓缩至含虫1×107个/mL,接纳MTT比色法测定胡桃楸提取物(JMME)及其含药血清对虫体增殖状况的影响,同时设置乙酰螺旋霉素为比较组,后果表现:胡桃楸提取物可分明克制弓形虫增殖,且具有剂量依赖性,浓度大于30μg/mL 的抑虫结果优于乙酰螺旋霉素组(P<0.05).弓形虫可经过胎盘屏蔽垂直传达至胎儿,孕妇熏染可惹起胎儿畸形( 无脑儿、脊柱裂)以及复活儿的后天性弓形虫病(智力低下、癫痫、致盲及殒命),严峻影响优生优育 。研讨标明: 胡桃楸提取物对弓形虫具有分明的增殖克制和毁坏作用,为研讨体外抗弓形虫药物奠基了实际根据 。该实行经过使用MTT比色法来察看虫体细胞在药物作用下的增殖形态,直接评价了药物抗弓形虫的作用结果,继而制止了传统弓形虫计数接纳的平凡染色计数法所带来的事情量大、偏差大的题目,合适抗虫药物的开端挑选。
2.1.3 乌骨藤对慢性髓性白血病细胞增殖克制作用
乌骨藤始载于《滇南本草》,性味苦,微寒,具清热解毒、消炎镇痛与止咳平喘等成效,可医治肺炎、慢性支气管炎、咳喘等疾病。古代药理研讨标明,乌骨藤含有多种甾体酯苷、生物碱、无机酸、多糖、树脂及色素等多种化学身分,其共同化学身分具有分明的抗肿瘤活性。曾琛等经过 MTT比色法探究乌骨藤提取物能否对人慢性髓性白血病K562细胞存在克制作用,后果标明:乌骨藤对 K562 增殖有分明的克制作用,同时亦可以分明克制人肺、胃、肝、大肠泉源的癌细胞,且毒反作用[fǎn zuò yòng]细微。但现在乌骨藤的抗肿瘤作用机制仍未完全分析,其质量控制目标也有待商讨。
2.2 癌细胞电离辐射敏理性研讨中的使用
2.2.1 c-erbB-2-siRNA 对结肠癌细胞的放射增敏作用
赵东利等接纳X射线单纯放射和放射团结使用siRNA质粒办法探究两者对结肠癌细胞 HT-2放射增敏结果。经过MTT比色法测定差别剂量X射线在实行组(A组)与转染试剂比较组(B组)、阴性子粒比较组(C组)细胞吸光度(A值),继而盘算比力各组细胞存活分数( SF)。实行数据表现,A组在吸光度A值、SF实行数据均分明低于B、C两组;同时,从差别剂量X射线细胞周期散布数据标明,在相反SF下,A组所需X射线剂量最低。综上阐明,对结肠癌细胞HT-29举行放射兼并c-erbB-2-siRNA可起到放射增敏作用,能在较低剂量射线作用降落低细胞生活率。本实行经过凋亡调治改动肿瘤放射敏理性,对临床在较小的毒副反响下医治肿瘤提供一个新的思绪。
2.2.2 肝癌细胞γH2AX表达与X射线剂量呈正相干
周萍等接纳MTT比色法检测差别剂量X射线照射肝癌细胞系HepG2后其吸光度A值及响应殒命率,从而探究肝癌细胞γH2AX表达程度与电离辐射敏理性干系。数据表现,1GyX射线照射时,HepG2殒命率为10.7%,以8GyX射线照射时,HepG2殒命率为47.4%。照射剂量在1~8Gy范畴内增大,HepG2殒命率亦渐渐增高,HepG2殒命率与X射线剂量呈正相干;同时,HepG2殒命率与表达γH2AX的细胞分数高度相干r2=0.951,P<0.05,HepG2灶点数与其殒命率高度相干,r2= 0.984,P<0.05。综上可知,X射线剂量与HepG2γH2AX表达呈正相干。
2.2.3 重离子诱导人舌鳞癌细胞凋亡
重离子因具有高传能线密度,在肿瘤医治中比传统的放射医治具有明显上风. 有学者赐与人舌鳞癌Tb细胞重离子束12C6+辐射,探究重离子对细胞凋亡及 Bax/Bcl-2卵白表达影响,接纳MTT比色法检测细胞存活率。据MTT比色法绘制的剂量-效应曲线表现,Tb细胞经12C6+辐射后,存活率明显降落,呈剂量依赖性增殖克制,此中12C6+辐射24h、48h后细胞存活率降落最为分明。综上阐明,对Tb细胞赐与24h以上的12C6+辐射,其DNA毁伤水平高于本身基因修复才能,继而凋亡相干基因被激活并诱导细胞凋亡,这意味着Tb细胞受重离子辐射后开脱了对放射线顺从期(G0/G1期),而进入对放射线敏感期(G2/M期),这也是临床支解放疗和超支解放疗的实际底子之一,本实行为该实际提供了实际根据。
 
完毕语
MTT法在许多范畴都有使用,在此就纷歧一叙说了,但人们照旧比力体贴其在癌症方面的使用,盼望经过它可以找到医治癌症的药物,让癌症不再让人以为恐惊,让j9九游人类的寿命可以更长一点,能做更多的事。
 
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